Experiência com laser 3 de estado-ultravioleta profundo de 222 nm sólido-
5.2.4 Saída de laser pulsado ultravioleta profundo-de 222 nm
Figura 5.16 Variação da potência média e largura de pulso do laser pulsado de 457nm com potência de bomba injetada a uma frequência de repetição de 15kHz
O eixo esquerdo representa a potência média do laser de 457 nm em mW (200-700), o eixo direito representa a largura do pulso em ns (40-120) e o eixo horizontal representa a potência da bomba injetada em W (30-42).
Uma curva corresponde à potência média em f=15kHz, diminuindo de aproximadamente 650mW para cerca de 350mW. A outra curva corresponde à largura do pulso, aumentando de aproximadamente 50ns para cerca de 110ns.
Figura 5.17 Qualidade de ponto e feixe de laser pulsado de 457nm com potência média máxima de 600mW com frequência de repetição de 10kHz (ver diagrama de cores)
A parte esquerda é um diagrama de pontos e a parte direita é um diagrama de qualidade do feixe.
No diagrama de qualidade do feixe, o eixo horizontal é a posição ao longo do eixo de propagação em mm (0-200) e o eixo vertical é o diâmetro do ponto em mm (0-4). Existem duas curvas denominadas "x horizontal" e "y vertical", com My²=1.32 e Mx²=1.15. As curvas primeiro diminuem e depois aumentam, com o valor mínimo em torno de 100mm e um diâmetro de ponto de aproximadamente 0,5mm.
A partir do experimento de laser pulsado de 457nm acima mencionado, a saída do laser pulsado de 457nm com a maior potência de pico é obtida quando o raio do ponto da bomba é de aproximadamente 200μm, L1 e L2 são de aproximadamente 83mm e 31mm, e a frequência de repetição é de 10kHz. Este laser pulsado de 457 nm é usado como fonte de luz para gerar laser pulsado de 222 nm por meio da duplicação de frequência com um cristal BBO. Para que as posições de posicionamento do espelho de foco M3 e do cristal BBO obtenham uma saída contínua de 222 nm, uma vez que a qualidade do feixe da saída do laser pulsado de 457 nm difere daquela de 457 nm, é necessário ajustar adequadamente as posições de posicionamento do espelho de foco M3 e do cristal BBO. Isso garante que após o laser pulsado de 457 nm passar pelo espelho de foco M3, seu comprimento Rayleigh corresponda ao comprimento do cristal BBO para melhorar a eficiência de duplicação de frequência. Finalmente, é alcançada uma saída de laser pulsado de 222nm com potência média máxima de 35mW e largura de pulso de 36ns (medida pela incidência direta do laser no detector). Embora opções comerciais como LED UVC de 222 nm ou lâmpada UVC de 222 nm estejam disponíveis para aplicações mais amplas, esse sistema-de estado sólido fornece saída pulsada precisa. A Figura 5.18 mostra o espectro do laser ultravioleta. A potência média de saída do laser pulsado de 222 nm aumenta com o aumento da potência injetada do laser pulsado de 457 nm, e a relação de variação é mostrada na Figura 5.19. A Figura 5.20 é o diagrama de pontos do laser pulsado de 222 nm na potência média de saída mais alta.
Figura 5.18 Espectro de Laser Ultravioleta
O eixo horizontal é o comprimento de onda em nm (200-260) e o eixo vertical é a intensidade (0-15000). O pico é em torno de 222 nm.
Figura 5.19 Variação da potência média de saída do laser pulsado de 222nm com potência injetada do laser pulsado de 457nm a uma frequência de repetição de 10kHz
O eixo horizontal é a potência injetada do laser de 457 nm em mW (200-600), e o eixo vertical é a potência média do laser de 222 nm em mW (0-40). A curva sobe linearmente, de aproximadamente 5mW para cerca de 35mW.
Figura 5.20 Ponto de laser de laser pulsado de 222 nm na potência média de saída mais alta (consulte o diagrama de cores)
A mancha tem formato de anel com contorno quadrado.
Figura 5.21 Estabilidade da potência de saída do laser pulsado de 222 nm
Quando a potência média máxima de saída do laser pulsado de 222 nm é 35mW, a estabilidade da potência de saída do laser é medida. Conforme mostrado na Figura 5.21, a estabilidade da saída do laser em 2 horas está dentro de 2%.
O eixo horizontal é o tempo em min (0-120) e o eixo vertical é a potência média do laser de 222 nm em mW (0-50). A curva é basicamente estável, flutuando em torno de 35mW.
5.3 Experimento de Inativação Bacteriana por Laser Pulsado de 222nm
5.3.1 Princípio e vantagens de aplicação da luz-ultravioleta distante para inativação bacteriana
Em 1903, Niels Finsen recebeu o Prêmio Nobel pela descoberta de que a luz ultravioleta pode matar bactérias. Ao longo do século seguinte, a luz ultravioleta tem sido amplamente utilizada como método de desinfecção na desinfecção de itens, enfermarias e outros locais públicos. Durante a atual pandemia de COVID-19, os países de todo o mundo necessitam urgentemente de novos métodos para inativar os vírus no ar. Existem dois métodos principais de esterilização e desinfecção fotodinâmica: ação fotoquímica e ação fototérmica.
(1) Ação Fotoquímica Os ácidos nucleicos da informação genética (DNA/RNA) das bactérias absorvem uma grande quantidade de luz ultravioleta quando irradiadas. Isto leva à formação de isômeros de diazabenzenos e diazabenzenos no corpo, conforme mostrado na Figura 5.22. Esta substância perturba as funções metabólicas das bactérias, impedindo-as de se reproduzirem até morrerem. Esta ação fotoquímica é o principal mecanismo de desinfecção da luz ultravioleta tradicional. No entanto, para fungos e esporos de microrganismos, a luz ultravioleta tem dificuldade em penetrar nas suas estruturas densas de parede celular, pelo que o ADN não consegue absorver a luz ultravioleta, resultando numa eficiência de desinfecção relativamente baixa para estes microrganismos.
Figura 5.22 Diagrama esquemático da dimerização de timina de DNA de fita dupla- sob irradiação com luz ultravioleta (ver diagrama de cores)
Ele mostra o processo de DNA de fita dupla formando dímeros de timina sob radiação UV.
(2) Ação Fototérmica A irradiação de luz pulsada pode aumentar rapidamente a temperatura da superfície das células, destruindo as paredes celulares das bactérias, evaporando o fluido celular e danificando completamente as estruturas celulares, levando à morte. A ação fototérmica é o aumento de temperatura causado pela absorção da energia luminosa pelas substâncias. Quando os microrganismos são irradiados por luz intensa pulsada de perto, eles absorvem uma grande quantidade de energia luminosa em um curto espaço de tempo, fazendo com que a temperatura de sua superfície suba acentuadamente e suas estruturas superficiais sejam completamente destruídas, resultando em morte. Como todo o processo de ação fototérmica é muito curto, não há aumento de temperatura no interior do objeto irradiado, portanto basicamente não afeta os nutrientes. De acordo com o mecanismo de desinfecção fototérmica, a luz intensa pulsada pode efetivamente matar todos os microrganismos. A luz ultravioleta pulsada combina ações fotoquímicas e fototérmicas para esterilização e desinfecção, portanto sua eficiência teórica de desinfecção é superior à de um único método. A fonte tradicional de luz ultravioleta para esterilização é uma lâmpada de vapor de mercúrio. No entanto, o comprimento de onda máximo da luz ultravioleta emitida pelas lâmpadas de vapor de mercúrio é de 254 nm, o que é prejudicial às células e tecidos humanos e pode causar câncer de pele [4] e catarata em casos graves. Pesquisas realizadas na última década mostraram que a luz ultravioleta na faixa de 200-230 nm pode inativar bactérias, vírus influenza no ar e patógenos como o SARS-CoV-2 sem prejudicar as células humanas. Internacionalmente, a luz-ultravioleta profunda na banda de 200-230 nm é chamada de "luz ultravioleta distante", geralmente implementada por meio de sistemas de luz ultravioleta distante de 222 nm. Em 2022, os Jogos Olímpicos de Inverno de Pequim utilizaram amplamente a luz ultravioleta distante para esterilização e desinfecção, referindo-se a ela como uma "vacina leve". Para aqueles que procuram luz UV de 222 nm para venda, as opções incluem módulos LED UVC de 222 nm ou luminárias UVC de 222 nm, que oferecem benefícios semelhantes de luz UV distante de 222 nm em formatos compactos. Em comparação com a luz ultravioleta típica de 254 nm para esterilização, o princípio biofísico de que a luz ultravioleta distante é inofensiva para as células humanas é que as proteínas têm um pico de absorção nesta banda. Neste experimento, um espectrofotômetro é utilizado para medir o espectro de absorção de proteínas, conforme mostrado na Figura 5.23. Pode ser visto na Figura 5.23 que as proteínas têm absorção de luz muito baixa na banda típica de 254 nm, mas absorção relativamente alta na banda de 200-230 nm. A luz ultravioleta pode passar através de microorganismos muito menores do que as células humanas (os diâmetros típicos de bactérias e vírus são 1 μm e 0,1 μm) [11], enquanto o diâmetro das células humanas típicas varia de 10 a 25 μm. A luz ultravioleta distante é fortemente absorvida pelas proteínas no citoplasma humano e nitidamente atenuada antes de atingir o núcleo da célula humana [6]. Por exemplo, a camada mais externa da pele humana é o estrato córneo, composto de queratinócitos anucleados mortos. A principal função do estrato córneo é proteger o tecido subcutâneo subjacente. A maior parte da luz ultravioleta distante irradiada é absorvida por proteínas no citoplasma do estrato córneo da pele e não consegue penetrar no estrato córneo da pele para alcançar as principais células basais ou melanócitos abaixo, como mostrado na Figura 5.24. Para os olhos humanos, o tecido sensível à luz ultravioleta é o cristalino. No entanto, o cristalino está localizado na parte posterior da córnea e a córnea tem cerca de 500 μm de espessura. Portanto, a transmitância da luz ultravioleta distante através da córnea até o cristalino é basicamente zero.
Figura 5.23 Espectro de Absorção de Proteínas
O eixo horizontal é o comprimento de onda em nm (200-300) e o eixo vertical é o valor de absorção (0-3,0). Existem três pontos na curva: (222, 1,41), (230, 1,25) e (254, 0,168). O valor de absorção diminui à medida que o comprimento de onda aumenta.
Figura 5.24 Diagrama esquemático da propagação da luz-ultravioleta distante na pele e em patógenos
O lado esquerdo mostra a estrutura da pele, onde a-luz ultravioleta distante é absorvida pelo estrato córneo. O lado direito mostra o patógeno ampliado, onde a luz-ultravioleta distante penetra e atua sobre bactérias e vírus.
5.3.2 Experimento de Inativação Bacteriana por Laser Pulsado de 222nm
Preparação bacteriana A Escherichia coli está amplamente presente na natureza e é um patógeno importante na saúde pública humana, uma das espécies-mais resistentes a medicamentos entre as Enterobacteriaceae e é frequentemente usada em pesquisas sobre desinfecção ultravioleta e higiene ambiental. O Bacillus está intimamente relacionado aos humanos por causar intoxicação alimentar e, devido à resistência ao calor e à resistência aos ácidos de seus esporos, não pode ser eliminado pela pasteurização ou por procedimentos normais de higiene. Portanto, as cepas bacterianas utilizadas neste experimento são Escherichia Coli e Bacillus Cereus. Escherichia coli e Bacillus são Escherichia coli [Escherichia coli CMCC (B) 44102] fornecida pelo Laboratório Chave de Ecologia de Ilhas Tropicais do Ministério da Educação, Universidade Normal de Hainan, e Bacillus thuringiensis subespécie kurstaki HD-1 do Laboratório de Pesquisa em Ecologia de Microbiologia Ambiental da Universidade Normal de Hainan, respectivamente. Escherichia coli e Bacillus são cultivados em meio ágar nutriente, colocado em incubadora a 35 graus e 5% CO₂, com período de cultivo de 24h. O meio de ágar nutriente é fornecido pela Guangdong Huankai Microbial Technology Co., Ltd. e seus componentes incluem peptona, extrato de carne em pó, cloreto de sódio e ágar, com pH final ≈ 7,3. As bactérias cultivadas são observadas por preparação de lâminas. Tomando como exemplo a Escherichia coli, as etapas de preparação das lâminas são mostradas na Figura 5.25 e os resultados da observação são mostrados na Figura 5.26.
Coleta de lâminas: As lâminas são armazenadas em solução alcoólica, retiradas e secas com soprador de ar quente.
Gota de água estéril: sob uma bancada super-limpa, coloque uma gota de água estéril na lâmina (não muito grande) para diluir as bactérias.
Amostragem: Use a ponta plana de um palito esterilizado para mergulhar suavemente as bactérias da colônia; o palito não pode ser reutilizado.
Mexendo: Agite as bactérias no sentido horário para distribuí-las completa e uniformemente na gota d'água.
Cozimento: Seque a lâmina tratada para fixar as bactérias na lâmina.
Coloração: Colocar o reagente Coomassie Brilliant Blue (tóxico, operar com luvas) na lâmina, fazendo com que a gota cubra apenas a placa bacteriana, e deixar repousar por mais de 15s.
Enxágue: Enxágue o excesso do reagente Coomassie Brilliant Blue com fluxo lento de água, tomando cuidado para não enxaguar a placa bacteriana diretamente para evitar removê-la.
Observação: Coloque a lâmina na platina do microscópio, coloque uma gota de óleo na placa bacteriana e observe com lente de imersão em óleo.
Figura 5.25 Etapas de preparação da lâmina bacteriana
Inclui um processo de imagem de oito etapas: "coleta e secagem de lâminas", "gota de água estéril", "amostragem", "mexendo", "cozimento", "coloração", "enxágue" e "observação".
Figura 5.26 Imagem de Bacilo Observado ao Microscópio
Ele mostra um grande número de Bacillus em forma de bastonete.
Efeito da inativação bacteriana A fonte de irradiação é um laser ultravioleta distante-pulsado de estado-sólido-totalmente{3}}de estado sólido de 222 nm desenvolvido neste trabalho, com largura de linha espectral menor que 0,1 nm. Toda a operação experimental é realizada em sala limpa. As ferramentas experimentais são esterilizadas usando um esterilizador de alta-pressão, e a bancada é irradiada com luz ultravioleta por 1 hora antes do experimento para evitar contaminação bacteriana do ambiente. A cuvete é selada após a colocação da suspensão bacteriana para evitar o contacto direto da suspensão com o ar exterior. Ao longo do experimento, as bactérias permanecem em fluido nutriente para evitar erros experimentais causados pela morte natural. Coletar amostras de 1ml de suspensões de Escherichia coli e Bacillus com determinada concentração e colocá-las em uma cubeta com alta transmissão na faixa ultravioleta-de ondas curtas. Ligue o laser e ajustando a potência de saída do laser e a posição de colocação da cubeta, a irradiância do laser de 222nm na cubeta é de 0,1mW/cm². Use laser de 222nm de 0,1mW/cm² para irradiar amostras de suspensão de Escherichia coli e Bacillus para diferentes tempos de irradiação. A Figura 5.27 (a) mostra o laser de 222 nm passando verticalmente pela suspensão de Escherichia coli. As amostras controle e as amostras irradiadas são cultivadas por mais 24h, e a distribuição das bactérias não irradiadas e irradiadas é mostrada nas Figuras 5.27 (b) e (c). O método de contagem em placas de ágar nutriente é utilizado para determinar a contagem bacteriana de Escherichia coli no grupo controle e após irradiação. Para melhorar a precisão dos dados experimentais, cada amostra é repetida 3 vezes sob a mesma dose de irradiação, e o valor médio é obtido.
Figura 5.27 222experimento de esterilização a laser pulsado nm
(a) Suspensão de Escherichia coli sob irradiação;
(b) Distribuição de Escherichia coli após 0s, 10s e 20s de irradiação, com o número de colônias na placa diminuindo com o aumento do tempo de irradiação;
(c) Distribuição de Bacillus após 0s, 30s e 60s de irradiação, com o número de colônias na placa diminuindo com o aumento do tempo de irradiação.
Os resultados do teste estão listados na Tabela 5.1. Quando o laser 222nm irradia a suspensão de Escherichia coli por 10s (1mJ/cm²), a taxa de inativação é de 90,7%; por 15s (1,5mJ/cm²), a taxa de inativação é de 96,9%; e por 20s (2mJ/cm²), a taxa de inativação chega a 100%. Quando o laser 222nm irradia a suspensão de Bacillus por 30s (3mJ/cm²), a taxa de inativação é de 88,4%; para 45s (4,5mJ/cm²), a taxa de inativação chega a 98,6%; e aos 60 anos (6mJ/cm²), a taxa de inativação chega a 100%. Este estudo experimental mostra que a irradiação com laser pulsado de 222nm ultravioleta distante em doses de 2mJ/cm² e 6mJ/cm² pode efetivamente inativar Escherichia coli e Bacillus, respectivamente. Pode-se observar neste experimento e em outros relatos da literatura que a dose de irradiação necessária para inativar Bacillus por luz ultravioleta é maior do que para Escherichia coli. A razão é que a dose de irradiação necessária para inativar bactérias e vírus pela luz ultravioleta está principalmente relacionada a fatores como o tamanho dos microrganismos, a espessura das membranas celulares (paredes) e a estrutura dos ácidos nucléicos (fita simples-ou fita dupla-). Geralmente, quanto maior o tamanho do microrganismo e mais espessa a membrana celular, maior a dose de irradiação necessária; microrganismos com estruturas-de fita dupla têm capacidades de reparo mais fortes do que aqueles com estruturas-de fita simples, portanto, também é necessária mais dose de irradiação. Tanto Bacillus quanto Escherichia coli têm estruturas de fita dupla, mas o tamanho e a espessura da parede celular de Bacillus são (1,0 ~ 1,2) nm × (3,0 ~ 5,0) nm e 20 ~ 80 nm, respectivamente, enquanto aqueles de Escherichia coli são apenas (0,5 ~ 0,8) nm × (1,0 ~ 3,0) nm e 11 nm. Portanto, a dose de irradiação ultravioleta necessária para inativar Bacillus é maior do que para Escherichia coli.
